输入的干细胞在人体中的宿命
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撰文｜东海先生
编辑｜南风
介绍一篇文章，虽然发表于2009年的《stem cells》杂志，但是至今没见到同类的文章能超越这篇文章。（本文特指间充质干细胞）
这篇文章的核心：
即为小鼠骨髓间充质干细胞（MSC）在抑制免疫反应的同时，能被免疫系统所清除，同时引发免疫记忆，从而加速后续输入MSC的清除速度；
生物学遗传背景相差越远，则清除速度越快；因此证明了MSC并不是通过分化来发挥治疗作用。
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文章详解
【结果】
1，MSC的鉴定和成纤维细胞的比较
经过CD11b阴性选择纯化的MSC，能成脂和成骨分化，100%表达CD29、87%表达Sca-1、62%表达CD44、53%表达CD49e和24%表达MHC-I类抗原。而成纤维细胞只能成脂分化，89%表达CD29、4%表达Sca-1、6%表达CD44、99%表达CD49e和46%表达MHC-I类抗原。【注：小鼠MSC和大鼠MSC的鉴定一直没有全球化的统一标准。从本文的指标结果来看，MSC虽然经过CD11b的分析，但是纯度依然不够，比如CD44达不到95%以上。】
2，MSC的免疫抑制研究
（1）体外细胞实验
分别利用特异性抗原刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖。在MSC和T细胞的比例为1：4时，MSC抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的抑制率分别为87%和76%。当提高MSC的数量到1：2时，MSC抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的抑制率超过90%。而成纤维细胞无法有效地抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。
（2）骨髓移植实验
骨髓移植后，如果去除供体的T细胞，那么移植后的存活时间延长。在存在供体T细胞的情况下，出现明显的骨髓移植排斥反应。MSC治疗可以抑制排斥反应，延长移植小鼠的生存时间，但是成纤维细胞无法做到这点。因此，进一步证明了成纤维细胞不具有免疫抑制能力。
【点评】：本文的免疫抑制实验阐述了3点：即MSC的抑制T细胞激活增殖的效率呈剂量依赖性；MSC的免疫抑制作用没有种属限制性和没有MHC限制性；这两个MSC剂量（2x106/每只和4x106/每只）对于本实验用的小鼠没有疗效上的差异。另外，如果提高或者降低MSC的剂量，是否对疗效产生足够明显的影响？
3，MSC进入体内后的免疫原性实验
（1）异体MSC腹腔注射后的存活时间
在免疫系统健全的小鼠（Balb/c）体内，MSC在腹腔存在的时间明显缩短，而成纤维细胞的存在时间更短，只有10来天。但是，在免疫缺陷的小鼠（Nude小鼠和NOD/SCID小鼠）体内，MSC和成纤维细胞的存在时间明显延长，可以超过120天。从荧光强度来看，MSC存在的数量超过相同时间点的成纤维细胞。
（2）MSC静脉注射后的存活时间
MSC静脉注射后，在体内的MSC信号在第20天开始减少。异体MSC的信号在第40天时完全消除，异体成纤维细胞在第15天时完全被清除。相比之下，这两种细胞类型在同基因受体中存活均超过40天。
（3）成纤维细胞和MSC诱导免疫记忆
裸鼠（Nude小鼠）和Balb/c小鼠接受2次的异体Luc+细胞注射，相隔30天。第1次注射Luc+成纤维细胞的信号只能存在14天，而第2次的异体成纤维细胞在第二天即被排斥清除。有意思的是，即使第1次注射的是Luc+MSC，亦能诱导免疫细胞对成纤维细胞的记忆，从而加速第2次注射的Luc+成纤维细胞的清除。【注：这个实验现象与MSC诱导免疫抑制的现象刚好相反。】
TCR转基因2C和TEA小鼠接受2次的分别来源于CB6/F1小鼠和SJL小鼠的骨髓MSC注射，每次注射相隔40天。TEA-CD4+和2C-CD8+细胞只能通过其MHC分子识别CB6/F1小鼠的细胞，而SJL来源的骨髓MSC则不能被这些转基因小鼠T细胞的TCR转基因识别。
在第一次注射MSC的55天后，在小鼠脾脏中流式分选CD4+T细胞和CD8+T细胞，流式检测记忆性T细胞表面标记物。在接受CB6/F1小鼠骨髓MSC注射后，TEA转基因小鼠脾脏中记忆性CD4+T细胞增加到41%，而接受SJL小鼠骨髓MSC注射后，TEA转基因小鼠脾脏中记忆性CD4+T细胞只增加到7%。
相似，在接受CB6/F1小鼠骨髓MSC注射后，2C转基因小鼠脾脏中记忆性CD8+T细胞增加到26.5%，而接受SJL小鼠骨髓MSC注射后，TEA转基因小鼠脾脏中记忆性CD8+T细胞只增加到0.6%。
【注：这个实验现象提示不同品系小鼠的骨髓MSC引起免疫记忆的程度不同。CB6/F1小鼠是雌性Balb/c和雄性C57BL/6杂交的第一代动物，SJL小鼠是三种品系的Swiss Webster小鼠杂交后经过近交培育而成。TCR转基因2C和TEA小鼠是FVB遗传背景，Swiss Webster小鼠杂交而来。】
【点评】：MSC的体内检测实验阐述了3点：
MSC进入体内后被免疫系统所清除，免疫系统功能越健全，MSC在体内的清除速率就越快；
局部注射MSC能延长MSC在体内的存在时间，而静脉注射MSC更容易被机体免疫系统所清除；
遗传背景差异越大的MSC，越能引起免疫记忆，从而加速后续进入体内的MSC的清除。
【材料和方法】
1，动物：6-12周龄的小鼠，品系为CB6/F1、FVB、转基因Luc+ FVB（FVB/N-L2G85）、SJL、C3H/HeJ、Balb-Nude、Balb-SCID、转基因H-2b小鼠。
2，细胞：小鼠骨髓MSC、小鼠皮肤成纤维细胞、小鼠CD4+T细胞、小鼠CD8+T细胞。
3，MSC的培养：IMEM、10%FCS、1%维生素、1%非必需氨基酸、2%谷氨酰胺、1%双抗。原代培养14天后，磁珠分选去除CD11b阳性的细胞。
4，MSC的鉴定：成脂分化和成骨分化、细胞表面标记物：SCA-1、MHC-I（H2Ld）、CD11b、CD29、CD49e、CD44、Vα2/Vβ6。
5，混合淋巴细胞反应（MLR）：效应细胞为转基因2C或TEAH-2b小鼠的脾细胞，刺激细胞为经过20Gy照射的CB6/F1小鼠脾细胞，抗原为H-2Ld或I-Ab，流式（FACS）检测效应T细胞的增殖。
6，T细胞介导的骨髓移植排斥实验：对C3H/HeJ小鼠进行照射（10 Gy），第二天注射纯化的1.5万个宿主T细胞重建。这些C3H/HeJ小鼠接受移植4x106个异基因（不含T细胞）CB6/F1的骨髓细胞，以及来自不同基因型（CB6/F1或FVB）或Fib（FVB供体类型）的不同剂量的MSC，MSC的剂量为每只小鼠（2-4）x106个细胞。每天监测小鼠的存活情况。
7，IVIS系统检测Luc+细胞的成像：FVB、Balb/c、Balb-Nude、Balb-SCID小鼠分布通过腹腔或静脉注射FVB小鼠来源的Luc+MSC或Luc+Fib（Fib即为成纤维细胞），观察周期最长为120天。
8，转基因2C或TEA小鼠的记忆性淋巴细胞的检测：转基因2C或TEA小鼠接受CB6/F1小鼠和SJL小鼠的骨髓MSC注射2次，每次注射相隔40天。在第一次注射MSC的55天后，在小鼠脾脏中流式分选CD4+T细胞和CD8+T细胞，流式检测记忆性T细胞表面标记物。
【温馨提示】
理性看待研究性文章结果，怀着科学的态度，合理质疑或接受，同时需要考虑到不同的实验条件对实验结果的影响程度。
本篇文章还是属于现象的研究，从免疫反应的角度去初步探讨影响MSC在体内存留时间的因素。
很多研究已经明确了MSC进入体内后，由于免疫系统的存在，MSC并不能长期存活，没有足够的时间去分化为组织特异的细胞，所以MSC发挥治疗作用的机制不是分化。
本公众号曾经就MSC在体内与机体细胞的相互作用问题，做过一次深入的探讨和总结，请看原创文章《为何干细胞需要反复多次注射才能获得较好的疗效》（点击文章题目阅读）。
参考文献：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19750539/
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